细胞冻存是一种将细胞置于低温状态以降低细胞代谢、延长储存时间的方法。这一技术的目的是为后续实验或临床应用保护细胞资源。细胞冻存常采用慢冻原则，这一方法可以让细胞逐渐脱水，从而避免因冰晶形成过大而引起的损伤。

一、原理

当温度下降至-70℃时，细胞内的代谢和酶活性几乎完全停止，而在-130℃以下，细胞的存活率达到最佳水平。液氮的应用让细胞实现长期保存。冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能迅速穿透细胞膜，降低冰点并延缓冻存过程。同时，它也增加了细胞膜的通透性，提高了细胞内部离子浓度，减少了冰晶的形成，从而有效保护细胞。

二、贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液；

2. 用PBS冲洗细胞，添加胰酶进行消化（此过程与细胞传代相似）；

3. 消化结束后重悬细胞，转移至无菌EP管，1000rpm离心5分钟；

4. 弃去上清，加入预热的细胞冻存液，细胞冻存最佳密度为5×10^6~1×10^7/ml，最低不应低于5×10^5/ml；

5. 分装完成后，确保冻存管盖紧，并做好标记；

6. 将分装好的冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱过夜；

7. 然后将冻存管转移至液氮中长期保存。

三、悬浮细胞冻存操作步骤

1. 用移液管将细胞悬液均匀吹吸后移入离心管；

2. 1000rpm离心3分钟以收集细胞沉淀；

3. 用预热的冻存液重悬细胞，细胞冻存最佳密度为3-5×10^6/ml，最低不应低于5×10^5/ml；

4. 分装后，确保冻存管盖紧并做好标记；

5. 将分装好的冻存管置于程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；

6. 最后，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

注意事项

1. 细胞培养、传代及冻存过程必须严格遵循无菌操作规程。

2. 在传代时消化应适度，消化时间应依据消化液的种类、配制时间及使用数量而定，监控细胞形态变化，如发现胞质回缩或连接变松，需立即终止消化。

3. 传代工作应在细胞处于对数生长期、未达融合状态时进行。

4. 冻存液需提前配制，切勿直接将DMSO加入细胞悬液。

5. 应选择聚合度80%-90%且活力达90%以上的细胞进行冻存，以确保最佳的冻存状态。冻存密度可根据细胞类型进行调整。

6. 程序冻存盒、细胞冻存液等试剂需复温至室温备用。

7. 冻存前切忌过长的消化时间、过重的吹打力度、过大的离心速率或过长的离心时间，以避免细胞损伤。

8. 冻存管盖子必须拧紧，避免水浴复苏时水分渗入造成污染。

9. 细胞不能长期保存在-80℃冰箱中，存放时间不应超过3天。

10. 液氮或冰箱与细胞房距离较远时，需将细胞放置在干冰或冰盒中进行运输。

总之，细胞冻存是一项复杂而严谨的操作，只有在严格遵循标准操作程序的基础上，才能确保细胞在冻存过程中维持较高的活性与存活率。南宫28NG相信品牌力量，致力于提供优质的细胞冻存解决方案，助力生命科学研究。